Цитология

Электронная микроскопия

Во второй половине XX в. стал активно использоваться новый метод микроскопирования, дающий в 100 раз большее разрешение биологических объектов по сравнению со световой микроскопией, – электронная микроскопия.

В электронном микроскопе изображение строится с помощью узкого пучка электронов, с высокой скоростью проходящего через срез ткани и взаимодействующего с ним. Электроны могут поглощаться срезом или отклоняться от исходного направления, в результате чего узкий пучок электронов будет рассеиваться. В качестве устройств, формирующих и фокусирующих поток электронов до взаимодействия со срезом ткани и после этого, используются мощные кольцевые электромагниты. Напряжение в колонне электронного микроскопа достигает 100 000 вольт. Изображение строится на люминесцентном экране, который дает свечение при взаимодействии с электронами. Вместо отображения объекта на светящемся экране его изображение можно зафиксировать на фотопластинке, что дает возможность получить фотоснимок. Для изучения биологических объектов пришлось разрабатывать новые методы приготовления препаратов.

Фиксируют ткани для электронной микроскопии глутаровым альдегидом, который «сшивает» белковые молекулы, и дофиксируют тетраоксидом осмия, который стабилизирует двуслойные липидные мембраны и дополнительно фиксирует тканевые белки. Для получения срезов образцы ткани пропитывают полимерными смолами, которые затвердевают, образуя твердый пластмассовый блок. С него на специальном приборе ультрамикротоме стеклянными или алмазными ножами делают очень тонкие срезы толщиной 50–100 нм; с одной клетки можно приготовить 100–200 срезов. Затем срезы пропитывают солями тяжелых металлов (урана, свинца, фосфорно-вольфрамовой кислоты) для увеличения контрастности изображения. Готовые срезы помещают на тонкую медную сеточку, ячейки которой покрыты прозрачной полимерной пленкой, и просматривают в электронном микроскопе.

Кроме срезов, под электронным микроскопом изучают крупные биологические молекулы, структуру мембран, белковые глобулы, поверхность клеточных органоидов. При изучении поверхности органоидов или молекулярных комплексов добиваются контрастного изображения различными приемами. Обычно она достигается за счет напыления под углом к поверхности объекта тонкого слоя золота или платины. Толщина слоя золота на поверхности соответствует структурным особенностям объекта. Некоторые участки объекта будут иметь более толстый слой напыления, в других местах напыление будет отсутствовать из-за образования теневой зоны. Поток электронов в микроскопе направлен перпендикулярно к поверхности объекта, что обеспечит выявление светлых и темных участков на изучаемой поверхности, так как в зависимости от толщины слоя напыления металла степень поглощения электронов будет изменяться.

Электронная микроскопия обусловила значительный прогресс в развитии цитологии. Была описана тонкая структура ядра, всех цитоплазматических органоидов: эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, всевозможных вакуолей, митохондрий, пластид, центриолей (рис. 5.1). Именно с помощью электронной микроскопии было показано, что двуспиральная молекула ДНК, выделенная из бактерий, имеет форму кольца.

Электронная микроскопия, в которой изображение строится с помощью потока электронов, проходящих через объект, называется трансмиссионной. Ее разрешающая способность для биологических объектов 2 нм при увеличении ×100 000, что примерно соответствует диаметру двойной спирали ДНК.

Помимо трансмиссионной электронной микроскопии существует растровая (сканирующая) электронная микроскопия, когда изображение строится с помощью электронного луча, отраженного с поверхности изучаемого объекта. Такие электронные микроскопы называются сканирующими. В микроскопе образец сканируется узким пучком электронов. Когда луч электронов попадает на образец, то поверхность образца, на которую нанесен тонкий слой золота, испускает «вторичные электроны». Они регистрируются прибором и преобразуются в изображение на телевизионном экране. Максимальное разрешение сканирующего микроскопа меньше, чем трансмиссионного, и составляет 10 нм для биологических объектов, а увеличение ×20 000. С помощью сканирующих микроскопов изучают внутренние поверхности кровеносных сосудов, поверхности клеток и небольших структур. Сканирующий микроскоп дает объемное изображение.

Вопросы

1. Какие типы электронных микроскопов вы знаете? Каково их разрешение?

2. Какие структуры можно увидеть в ядре и цитоплазме с помощью трансмиссионного электронного микроскопа?

3. В чем состоит принцип построения изображения в электронном микроскопе?

4. В чем особенности приготовления препаратов для электронной микроскопии?