Цитология

Фракционирование клеток

С середины XX в. цитологи получили возможность исследовать не только целые клетки, но и отдельные органоиды, выделенные из клеток в жизнеспособном состоянии. Для этого используется метод фракционирования клеток, основанный на дифференциальном центрифугировании.

Для получения образцов органоидов фрагменты ткани разрушают таким образом, чтобы клеточные структуры остались неповрежденными. С этой целью подбирают подходящие условия гомогенизации, т. е. разрушения клеток, подходящую среду для выделения клеточных структур, буфер для поддержания определенного рН, в процессе выделения поддерживают низкую температуру, близкую к нулю. В результате получают суспензию клеточных органоидов, которая содержит ядра, митохондрии, лизосомы, аппарат Гольджи, фрагменты эндоплазматического ретикулума, рибосомы и обрывки клеточных мембран. Суспензию начинают центрифугировать на специальных приборах – центрифугах. Разные органоиды осаждаются на дно пробирки при разных скоростях центрифугирования. Скорость оседания зависит от размера частицы и ее плотности. При низких скоростях центрифугирования в первую очередь осаждаются ядра. Получив осадок ядер, оставшуюся суспензию переливают в другую пробирку для следующего этапа центрифугирования. Осадок, состоящий из клеточных ядер, размешивают и используют в экспериментальной работе. Так повторяют несколько раз, увеличивая скорость и продолжительность центрифугирования. Самые высокие скорости центрифугирования необходимы для получения самых маленьких органелл – рибосом. Ядра осаждаются на дно пробирки при центрифугировании в течение двух минут с ускорением 2000 g. Осадок митохондрий получают через 30 минут центрифугирования с ускорением 15 000 g, а рибосомы собирают через 3 часа центрифугирования с ускорением 40 000 g.

С помощью этого метода впервые в клетках были открыты лизосомы – небольшие вакуоли, содержащие гидролитические ферменты и выполняющие пищеварительные функции в клетках. После открытия лизосом методом фракционирования, их обнаружили на срезах клеток под световым и электронным микроскопом с помощью метода цитохимии, выявив работу специфических ферментов.

Возможность получения чистых фракций отдельных органоидов позволила изучить их химический состав, набор ферментов и, в конечном итоге, понять, как работает та или иная клеточная структура.

Вопросы

1. Что такое гомогенизация клеток?

2. Почему разные органоиды клетки при центрифугировании осаждаются на дно не одновременно?

3. Какие клеточные органоиды были открыты именно с помощью метода фракционирования клеток?